过去十余年间，CRISPR-Cas技术显著推动了真核生物基因编辑的发展，已被广泛应用于生物医学研究、基因治疗及农业育种等多个领域。近年来，多种V型CRISPR系统的相继发现，进一步扩展了基因编辑的工具箱。其中，V-I型Cas12i核酸酶因蛋白体积较小的明显优势，受到越来越多的关注。然而，天然Cas12i的编辑效率较低，限制了其在复杂细胞系、原代细胞和动物育种研究中的高效应用。因此，如何通过工程化改造进一步提升Cas12i活性，同时兼顾基因编辑特异性，成为该方向亟需解决的关键问题。

近日，《SCIENCE CHINA Life Sciences》在线发表西北农林科技大学羊遗传改良与生物育种创新团队魏迎辉教授、新疆农业大学郑文新研究员及新疆畜牧科学院吴伟伟研究员联合撰写的题为“Improving growth performance across multiple sheep breeds by targeting the MSTN gene using an enhanced Cas12i system”的研究性论文，评估了多种双链DNA结合蛋白（dsDBD）及外切酶与hfCas12Max融合后的编辑效果，开发出一种增强型Cas12i系统—hfCas12Max-T5，并在多个绵羊品种中验证了该系统在提升生长性能方面的高效安全应用。

为了进一步提升hfCas12Max的基因编辑效率，该研究分别将五种双链DNA 结合蛋白（HMG-D、HMGN1、HMGB1、H1G和Sso7d）及三种外切酶（TREX1、TREX2和T5）融合至hfCas12Max的N端或C端，并在多种细胞系的多个内源性位点上系统评估了各融合蛋白的编辑活性（图1A）。研究结果表明，除TREX1外，大多数C端融合变体的编辑效率均达到或优于原始hfCas12Max。其中，hfCas12Max-T5表现最为突出，在HeLa、U2OS和HEK293T细胞系中的平均编辑效率分别高达61.8%、73.07%和70.5%。在五种dsDBDs中，Sso7d 的编辑增强效果最为显著，具有平均1.25–1.57倍的效率提升（图1B-D）。进一步分析发现，C端融合变体在HEK293T细胞的B2M位点能够诱导更高的编辑活性，同时产生更宽的缺失尺寸（图1E）。此外，在绵羊胎儿成纤维细胞和肌肉细胞中，hfCas12Max-T5在MSTN基因的九个靶点上均展现出优于原始hfCas12Max的编辑能力（图1F-G），为其后续在绵羊个体水平上的基因编辑高效应用奠定了坚实基础。

图1 hfCas12Max系统的优化及其在多种细胞类型中的基因编辑效率评估

MSTN基因编码的肌肉生长抑制素是骨骼肌生长的负调控因子。研究团队利用hfCas12Max-T5系统靶向MSTN基因的第一外显子，对美利奴羊、宁夏滩羊和多浪羊三个品种进行了高效基因编辑，成功获得35只基因编辑羔羊，平均基因型编辑频率达80.1%（图2H-I）。表型评估结果显示，编辑羔羊的初生重及平均日增重均显著高于对照组（图2J-K）。长达6个月的纵向追踪进一步表明，编辑羊在体重、体高、体长和胸围等多项生长参数上均获得显著提升。此外，研究对hfCas12Max-T5介导的基因编辑美利奴羊进行了家系全基因组测序（WGS）。结果显示，与对照组相比，编辑组中SNV和Indel数量均未出现显著增加（图2L-N）。进一步利用Cas-OFFinder预测潜在脱靶位点，并将预测结果与实际检测到的SNV和Indel进行比对，发现在四个编辑家系中识别到的变异均未与任何预测脱靶位点重叠（图2O-P）。综上所述，hfCas12Max-T5系统在显著提升编辑效率的同时，展现出高度的基因编辑特异性，为其高效安全应用于家畜遗传改良提供了有力的实验证据与理论支持。

图2 hfCas12Max-T5介导的MSTN基因编辑绵羊生长性能与安全性评估

该文的共同第一作者为西北农林科技大学在读博士研究生刘波，硕士研究生宋环宇、颜淼、吴雨，以及新疆畜牧科学院畜牧研究所在读博士研究生李鹏飞。通讯作者为西北农林科技大学魏迎辉教授、新疆农业大学郑文新研究员、新疆畜牧科学院吴伟伟研究员。此外，西北农林科技大学羊遗传改良与生物育种创新团队陈玉林教授、王小龙教授，新疆畜牧科学院黄俊成研究员、汪立芹研究员、林嘉鹏研究员、吴阳升研究员，以及中国农业科学院北京畜牧兽医研究所刘志国副研究员为该研究提供了重要支持。

论文链接：//www.sciengine.com/SCLS/doi/10.1007/s11427-026-3369-1